ПЦР (полимеразная цепная реакция). Как производится ПЦР диагностика, показания, как подготовиться к исследованию, результат ПЦР и их интерпретация

Чем объясняется популярность ПЦР в настоящее время?

Этот метод точно определяет возбудителей инфекционных заболеваний и оценивает эффективность терапии.

В руководствах, брошюрах и статьях врачей-экспертов часто используются сложные термины. Объяснить высокотехнологичные научные продукты простыми словами бывает непросто.

ПЦР диагностика является одним из самых точных методов выявления инфекционных заболеваний. Врачи отмечают, что процесс начинается с забора биологического материала, чаще всего это мазок из носоглотки или слюна. Затем в лаборатории происходит амплификация ДНК или РНК патогена, что позволяет обнаружить даже минимальные количества вируса или бактерии.

Показаниями для проведения ПЦР могут служить симптомы инфекционных заболеваний, такие как высокая температура, кашель или затрудненное дыхание, а также необходимость подтверждения или опровержения диагноза. Врачи рекомендуют заранее подготовиться к исследованию: избегать приема пищи и жидкости за 30 минут до забора материала, чтобы избежать загрязнения образца.

Результаты ПЦР теста обычно готовы в течение нескольких часов или дней, в зависимости от лаборатории. Врачи подчеркивают, что точность теста достигает 95%, что делает его надежным инструментом для диагностики. Однако важно помнить, что интерпретацию результатов должен проводить квалифицированный специалист, который учтет все клинические данные пациента.

Что такое ПЦР?

В чем суть и механика ПЦР диагностики?

Каждый организм имеет уникальный набор генов, расположенных в молекуле ДНК, которая служит «визитной карточкой» существа. ДНК — это длинная молекула, состоящая из нуклеотидов. У патогенов инфекционных заболеваний нуклеотиды расположены в определённой последовательности. Для определения наличия патогена у человека берётся биологический материал (кровь, моча, слюна, мазок), содержащий ДНК или её фрагменты. Однако количество генетического материала возбудителя может быть крайне незначительным, что затрудняет его идентификацию. Для решения этой проблемы используется полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод заключается в том, что изначально берётся небольшое количество исследуемого материала с ДНК, а в процессе ПЦР увеличивается объём генетического материала, относящегося к определённому возбудителю, что позволяет его идентифицировать.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это метод, который позволяет выявлять генетический материал патогенов, таких как вирусы и бактерии, с высокой точностью. Процедура начинается с забора образца, чаще всего из носоглотки или слюны. Затем в лаборатории происходит экстракция ДНК или РНК, после чего добавляются специальные реагенты, которые запускают процесс амплификации.

Показания для проведения ПЦР могут включать симптомы инфекционных заболеваний, необходимость диагностики COVID-19, а также мониторинг хронических инфекций. Подготовка к исследованию обычно не требует особых мер, но рекомендуется избегать еды и питья за 30 минут до забора образца, чтобы минимизировать риск загрязнения.

Результаты ПЦР-диагностики могут быть как положительными, так и отрицательными. Положительный результат указывает на наличие инфекционного агента, тогда как отрицательный может свидетельствовать о его отсутствии или о том, что вирусная нагрузка слишком низка для обнаружения. Важно помнить, что интерпретацию результатов должен проводить квалифицированный специалист.

ПЦР — диагностика вирусной инфекции, коронавируса — наглядное объяснение метода

ПЦР диагностика – генетическое исследование биоматериала.

Идея полимеразной цепной реакции (ПЦР) была предложена американским ученым K. Mullis в 1983 году, но широкое применение в клинической практике началось лишь в середине 90-х годов XX века.

Разберемся в терминологии. Каждая клетка живого организма — животного, растения, человека, бактерии или вируса — содержит хромосомы, которые хранят генетическую информацию в виде последовательности генов, характерных для каждого организма.

Хромосома состоит из двух спирально закрученных нитей ДНК. ДНК, или дезоксирибонуклеиновая кислота, состоит из нуклеотидов. Существует пять типов нуклеотидов: тимин (Т), аденозин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц) и урацил (У). Нуклеотиды располагаются в определенной последовательности, формируя гены. Один ген может включать от 20 до 200 нуклеотидов. Например, ген, отвечающий за выработку инсулина, состоит из 60 пар нуклеотидов.

Нуклеотиды обладают свойством комплементарности: аденин (А) всегда соответствует тимину (Т), а гуанин (Г) — цитозину (Ц). Схематически это выглядит так:
Г — Ц
Т — А
А — Т
Это свойство комплементарности является основой ПЦР.

РНК, или рибонуклеиновая кислота, имеет аналогичную структуру, но вместо тимина содержит урацил. РНК хранит генетическую информацию у некоторых вирусов, известных как ретровирусы (например, ВИЧ).

Молекулы ДНК и РНК могут «размножаться», что используется в ПЦР. Процесс происходит следующим образом: две нити ДНК или РНК отделяются, и на каждую из них присоединяется фермент, который синтезирует новую цепочку по принципу комплементарности. Для начала синтеза ферменту требуется «затравка» — последовательность из 5-15 нуклеотидов, определенная для каждого гена (например, для хламидий, микоплазм, вирусов).

Каждый цикл ПЦР включает три стадии. На первой стадии происходит раскручивание ДНК, то есть разделение цепей. На второй стадии к участку нити ДНК присоединяется «затравка». На третьей стадии происходит удлинение нитей ДНК с помощью фермента-«строителя». Весь процесс осуществляется в одной пробирке и состоит из повторяющихся циклов размножения целевой ДНК, что позволяет получить большое количество копий, которые затем можно выявить с помощью стандартных методов. Таким образом, из одной нити ДНК можно получить сотни или даже тысячи копий.

Этапы проведения ПЦР исследования

ПЦР. Как его делают в научной лаборатории?

Забор биологического материала для исследования

В качестве образцов используются различные виды биологического материала: кровь и её составляющие, моча, слюна, выделения слизистых оболочек, спинномозговая жидкость, экссудат из раневых поверхностей и содержимое полостей тела. Образцы собираются с использованием одноразовых инструментов и помещаются в стерильные пластиковые пробирки или на культуральные среды, после чего транспортируются в лабораторию.

В собранные образцы добавляются необходимые реактивы, и они помещаются в термоциклер. В этом устройстве цикл полимеразной цепной реакции (ПЦР) повторяется от 30 до 50 раз и включает три основных этапа: денатурацию, отжиг и удлинение. Рассмотрим их подробнее.

Этапы непостредственно ПЦР реакции, копирование генетического материала

I этап ПЦР — Подготовка генетического материала для репликации.
При температуре 95° С происходит разъединение нитей ДНК, что позволяет «затравкам» присоединяться к ним.

«Затравки» производятся научно-производственными компаниями и приобретаются лабораториями в готовом виде. Каждая «затравка» предназначена для конкретного патогена, например, для выявления хламидий. Если анализируется биоматериал на наличие хламидийной инфекции, в реакционную смесь добавляется «затравка» для хламидий; для тестирования на вирус Эпштейн-Барра используется соответствующая «затравка».

II этап – Соединение генетического материала возбудителя инфекции и «затравки».
Когда в образце присутствует ДНК определенного вируса или бактерии, «затравка» связывается с этой ДНК. Этот процесс соединения «затравки» с ДНК проходит при температуре 75°С.

III этап — Репликация генетического материала возбудителя инфекции.
На этом этапе происходит удлинение генетического материала при температуре 72°С. К «затравкам» присоединяется фермент-«строитель», который синтезирует новую цепочку ДНК. Завершение синтеза новой цепочки означает окончание одного цикла ПЦР, в результате которого количество генетического материала удваивается. Например, если в исходной пробе 100 молекул ДНК вируса, после первого цикла ПЦР их станет 200. Один цикл занимает 2-3 минуты.

Для получения достаточного объема генетического материала для идентификации обычно проводят 30-50 циклов ПЦР, что занимает от 2 до 3 часов.

Этап идентификации размноженного генетического материала

На этом этапе процесс ПЦР завершается, и начинается важный этап — идентификация. Для этого используются методы электрофореза или меченых «затравок». При электрофорезе молекулы ДНК разделяются по длине, и наличие фрагментов различной длины указывает на положительный результат анализа, что свидетельствует о наличии вируса или бактерии. При использовании меченых «затравок» к конечному продукту реакции добавляется хромоген (краситель), что приводит к окраске в ходе ферментативной реакции. Появление окраски указывает на присутствие вируса или другого исследуемого агента в пробе.

Сейчас, благодаря меченым «затравкам» и соответствующему программному обеспечению, возможно одновременно проводить и «чтение» результатов ПЦР. Это называется real-time ПЦР.

Почему ПЦР диагностика обладает такой ценностью?

Одним из главных достоинств метода ПЦР является высокая чувствительность — 95-100%. Для достижения таких результатов необходимо:

1. правильный забор и транспортировка биоматериала;
2. использование стерильного одноразового инструментария и квалифицированного персонала в специализированных лабораториях;
3. строгое следование методическим рекомендациям и поддержание стерильности во время анализа.

Чувствительность метода зависит от типа микроорганизмов. Например, для вируса гепатита С она составляет 97-98%, а для уреаплазмы — 99-100%.

Потенциал ПЦР-анализа обеспечивает высокую аналитическую специфичность, позволяя точно идентифицировать искомый микроорганизм, а не его близкие виды. Чувствительность и специфичность ПЦР часто превосходят аналогичные показатели культурального метода, который считается «золотым стандартом» в диагностике инфекционных заболеваний. Учитывая длительность процесса выращивания культуры (от нескольких дней до нескольких недель), преимущества ПЦР становятся очевидными.

ПЦР в диагностике инфекций

Высокая чувствительность и специфичность метода ПЦР открывают широкие возможности для его применения в медицине. Основные сферы использования ПЦР-диагностики:

1. диагностика острых и хронических инфекционных заболеваний;
2. мониторинг эффективности терапии;
3. уточнение типа возбудителя.

Метод ПЦР активно применяется в акушерстве, гинекологии, неонатологии, педиатрии, урологии, венерологии, нефрологии, инфекционных болезнях, офтальмологии, неврологии, фтизиопульмонологии и других областях.

ПЦР-диагностика часто комбинируется с другими методами (ИФА, ПИФ, РИФ и др.). Комбинация методов определяется лечащим врачом.

Возбудители инфекций, обнаруживаемые методом ПЦР

Вирусы:

1. ретровирусы HIV-1 и HIV-2;
2. герпетические вирусы;
3. вирус простого герпеса 1 и 2 типов;
4. цитомегаловирус;
5. вирус Эпштейна-Барр;
6. вирус ветряной оспы (варицелла-зостер);
7. герпесвирусы человека 6 и 7 типов;
8. вирусы гепатита С, В и А;
9. вирусы папилломы человека;
10. вирус краснухи;
11. аденовирусы;
12. риновирусы;
13. парвовирусы;
14. пикорновирусы.

Бактерии:

1. микобактерии;
2. хламидии;
3. микоплазмы;
4. сальмонеллы;
5. легионеллы;
6. клостридии;
7. бледная трепонема;
8. патогенные виды кишечной палочки;
9. холерный вибрион;
10. риккетсии;
11. золотистый стафилококк;
12. бактериальные возбудители менингита;
13. хеликобактер пилори;
14. уреаплазма;
15. возбудитель гонореи;
16. дифтерийная палочка;
17. гемофильная палочка.

Этот список включает распространенные инфекционные агенты, выявляемые методом ПЦР. Перечень постоянно обновляется с разработкой новых «затравок». Также стоит отметить, что определяемые возбудители зависят от наличия «затравок» для идентификации в конкретной лаборатории.

Вопрос-ответ

Как проводится ПЦР-диагностика?

Как работает ПЦР? В ходе исследования пробирку с биоматериалом помещают в особые условия, под воздействием которых молекулы нуклеиновой кислоты (двухнитевую ДНК, присутствующую в пробе или синтезированную из однонитевой РНК), кодирующие генетическую информацию определённого патогена, многократно копируют.

Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР)?

ПЦР — это метод амплификации нуклеиновых кислот, включающий денатурацию, ренатурацию, удлинение и амплификацию короткого фрагмента ДНК или РНК. В этом процессе используется ДНК-полимераза, полученная из Thermus aquaticus, широко известная как Taq-полимераза.

Как правильно подготовиться к ПЦР-тесту?

Минимум за 3 часа до взятия мазков из ротоглотки (зева) нельзя: принимать пищу, пить, чистить зубы, полоскать рот/горло, использовать спрей-освежитель для ротовой полости, жевать жевательную резинку, курить.

Каковы 4 этапа процесса ПЦР?

Процесс ПЦР состоит из 4 этапов: сбор, подготовка, амплификация и очистка после ПЦР.

Советы

СОВЕТ №1

Перед проведением ПЦР-диагностики обязательно проконсультируйтесь с врачом. Он поможет определить необходимость исследования, а также объяснит, какие анализы лучше всего подойдут для вашей ситуации.

СОВЕТ №2

Подготовьтесь к исследованию заранее. Избегайте употребления пищи, алкоголя и курения за несколько часов до сдачи анализа, если это указано врачом. Чистота и правильная подготовка помогут получить более точные результаты.

СОВЕТ №3

Обратите внимание на сроки получения результатов. ПЦР-диагностика может занять от нескольких часов до нескольких дней, в зависимости от лаборатории. Уточните у медицинского учреждения, когда вы сможете получить результаты и как их интерпретировать.

СОВЕТ №4

Не забывайте о важности повторных тестов. Если результаты ПЦР-диагностики оказались положительными или сомнительными, следуйте рекомендациям врача и не пренебрегайте повторной проверкой для подтверждения диагноза.